مقاله ی در مورد میکروسکوپ

مقاله ی در مورد میکروسکوپ

مقاله ی در مورد میکروسکوپ

مقدمه:

 ميكروسكوپ يكي از وسايل آزمايشگاهي اصلي در آزمايشگاه گياه شناسي است . كه در اينجا انواع آن را مورد بحث و بررسي قرار داده و طرز كار با ميكروسكوپ نوري معمولي را به تفصيل ارائه مينمائيم .

ميكروسكوپهاي مختلف داراي بزرگنمائي هاي متفاوتي ميباشند كه عموماً با وجود عدسيهاي گوناگون، تصوير نمونه مورد نظر چند برابر ميشود . اصول كلي در تمامي انواع ميكروسكوپها براساس عبور نور با طول موجهاي متفاوت از چندين عــدسي محدب ميباشد كه هرچقدر طول موج نور بكار رفته در ميكروسكوپ مزبور كوتاهتر باشد قدرت تفكيك و يا جــداكنندگي آن ميكروسكوپ بيشتر است . براي مثال قدرت تفكيك چشم انسان 1/0 ميليمتر ميباشد و ميكروسكوپ نوري معمولي 24/0 ميكرون . بيشتر ميکروسکوپ هايي که تاکنون ابداع شده اند، ميکروسکوپ نوري بودند. ميکروسکوپ هاي نوري ميکروسکوپ هايي هستند که براي بررسي يک جسم، از پرتوهاي نور استفاده مي کنند و نور را به جسم موردنظر مي تابانند. با اين همه ميکروسکوپ نوري يک ضعف عمده دارد که محدوديت قدرت تفکيک آن است. به دليل ماهيت موجي نور، موج هاي مختلف موجود در يک پرتو نور، با يکديگر تداخل مي کنند. به همين دليل، وقتي با استفاده از عدسي يک پرتو نور را متمرکز مي کنيم، بسته به طول موج نور و زاويه يي که عدسي مي تواند نور را جمع کند، يک نقطه نوراني به پهناي 200 نانومتر در جهت هاي X و Y و عمق 500 نانومتر در راستاي Z تشکيل مي شود.در دهه 1930 انواع ميکروسکوپ هاي الکتروني ابداع شد. هر چند اين ميکروسکوپ ها همچنان گران است، اما استفاده از آنها متداول شد. با ابداع ميکروسکوپ هاي الکتروني (که از پرتوهاي الکترون به جاي پرتو نور استفاده مي کند) قدرت تفکيک به شدت افزايش يافت، زيرا طول موج پرتوهاي الکترون کمتر از طول موج فوتون است. فوتون «ذره» تشکيل دهنده نور است.هر چند با ابداع ميکروسکوپ هاي الکتروني دنياي کاملاً تازه يي از جزئيات به روي ما باز شد که پيش از آن مشاهده نکرده بوديم، اما استفاده از آن براي تصويربرداري از نمونه هاي زيستي چندان مناسب نيست. براي آنکه بتوانيم نمونه يي را با استفاده از ميکروسکوپ الکتروني مشاهده کنيم، بايد نمونه ها را در خلأ و به دور از هوا نگهداري کرد.

علاوه بر اين پيش از اينکه بتوان جسم را زير ميکروسکوپ تماشا کرد، بايد با استفاده از روش هايي آن را آماده کرد، از جمله برش جسم به لايه هاي نازک با استفاده از فلزهايي مثل اورانيوم، سرب يا پوشاندن نمونه با انواع فلزهاي رسانا. در هر مورد ماده زيستي شناختي مشاهده شده به وسيله ميکروسکوپ الکتروني ديگر زنده نيست.هر چند ميکروسکوپ الکتروني در زيست شناسي و پزشکي کاربردهاي فراواني دارد، اما مطلوب آن است که بدون کشتن نمونه ها بتوانيم قدرت تفکيک را زياد کنيم گرچه سلول هاي انسان ها و حيوانات به قدر کافي بزرگ است و مي توان با استفاده از ميکروسکوپ هاي نوري آنها را مشاهده کرد. کارکرد سلول به سنتز و انتقال پروتئين هايي بستگي دارد که با يکديگر بر هم کنش دارند يا به هم متصل مي شوند تا کار ويژه يي را انجام دهند. براي مثال واکنش هاي ايمني شناختي بدن ما به توانايي سلول ها براي توليد پروتئين هايي بستگي دارد که مي توانند با اجسام خارجي مقابله کنند. علاوه بر اين مرگ سلول ها نيز به پروتئين ها مربوط مي شود و ناتواني سلول ها براي مرگ کنترل شده به سرطان منجر مي شود. با توجه به اينکه قدرت تفکيک ميکروسکوپ هاي نوري معمولي حدود 200 نانومتر است، نمي توان چگونگي برهم کنش پروتئين را ديد و دريافت که آيا پروتئين ها اصولاً با يکديگر برهم کنش دارند يا خير، چگونه پروتئين ها به بخش هاي خاصي از سلول منتقل مي شوند و چرا وجود آنها در اين بخش خاص ضروري است. درک اين مکانيسم ها در پژوهش هاي پزشکي و ابداع روش هاي درماني جديد بسيار ضروري است.

تاريخچه

بعضي از وقايع مهم مربوط به ميكروسكوپ به شرح زيرند:

در سال 1655 روبرت هوگ كه يك فيزيكدان بود، اولين مشاهده‌ي ميكروسكوپي را انجام داد. وي براي اولين بار توانست بقاياي ديواره‌ي سلولهاي مرده‌ي گياهي را در برشي از چوب‌پنبه مشاهده كند. در سال 1674 آنتوني‌وان ليوون هوك. كه يك پارچه فروش بود، براي اولين بار توانست تك سلولهاي زنده (پروتوزوآ) را مشاهده كند. در سال 1683 آنتوني و آن ليوون هوگ با تكميل ميكروسكوپي كه ساخته بود، توانست باكتريها را نيز مشاهده كند. در سال 1932 اولين ميكروسكوپ الكتروني اختراع شد.

تاریخچه ميكروسكوپ

در روزگاران قديم, كوچكترين موجودات زنده ای كه مردم می شناختند آنهايی بودند كه به زحمت با چشم ديده می شوند. ولی آيا ممكن بود موجوداتی هم باشند كه با چشم ديده نشوند؟ اگر با چشم ديده نمی شدند، با چه وسيله ای ممكن بود آنها را ديد. البته در آن زمانم مردم به وسايلی می توانستند كاری كنند كه چيزهای خيلی كوچك بزرگتر از آنچه بودند نشان داده شوند. مثلاً بعضی ازمردم متوجه شده بودند كه اگر از ميان شيشه ای كه سطح آن منحنی باشد به چيزهای خيلی كوچك نگاه كنند, آنها بزرگتر از آنچه هستند به نظر می آيند.

با اين همه, فقط در حدود سال 1650 ميلادی بود كه دانشمندان با اين شيشه های منحنی به چيزهای خيلی كوچك نگاه كردند و به دقت به بررسی آنها پرداختند . اسم اين شيشه ها را, كه سطح منحنی داشتند, عدسی گذاشتند, زير اشكال آنها مثل شكل دانه های عدس بود. معمولاً برای اينكه به چيزهای بسيار كوچك نگاه كنند, بيش از يك عدسی به كار می بردند. عدسی ها را در دو انتهای يك لوله فلزی جا می دادند.

آنهارا طوری بر جا می دادند كه چيزهای بسيار كوچك بهتر ديده شوند. اسم اين لوله را, با عدسی هايی كه درون آن بود, ميكروسكوپ گذاشتند.

 ميكروسكوپ از دو واژه يونانی ميكرو, به معنی كوچك و سكوپ, به معنی ديدن, گرفته شده است. بنابراين ميكروسكوپ يعنی ديدن چيزهای كوچك. يكی از موجودات كوچك زنده كه دانشمندان بيش از همه آن را مورد مطالعه قرار دادند كك بود. برای همين بود كه اسم اولين ميكروسكوپ ها را شيشه های کكی گذاشته بودند.

قبل از اختراع ميكروسكوپ در اواسط قرن هفدهم, مشاهده سلول مقدور نبود, زيرا سلول واحد بسيار كوچكی است كه با چشم غير مسلح قابل رويت نيست. روبرت هوك اول بار در سال 1665 زير ميكروسكوپ ابتدايی كه خود ساخته بود سلولهای مرده را در  برش های چوب پنبه و نوعی كمك مشاهده كرد. اين سلولهای تو خالی و متصل به هم, شكل اتاقكهای لانه زنبور را داشتند و هوك آنها را سلولی ناميد كه به زبان لاتين مفهوم اتاقكهای كوچك را دارد.

 چند سال بعد طبيعت شناسی بنام آنتونی وان ليوون هوك سلولهای زنده را در قطره های آبی كه از بركه برداشته بود در زير ميكروسكوپ مشاهده كرد و آنها را جانوران كوچك ناميد.

او چند نمونه خشك شده خود را بين سالهاي 1674 و 1687 به فرهنگستان سلطنتي لندن فرستاد.

ليوون هوك بر روی هم توانست 419 ميكروسكوپ و عدسی بسازد. او هر بار كه عدسی يا ميكروسكوپ بهتری می ساخت, می توانست ميكرو ارگانيسمهای كوچكتری ببينید.

در سال 1683 ميلادی, عدسی ديگری ساخت كه می توانست چيزهای خيلی كوچك را نشان دهد. ليوون هوك فكر می كرد كه اين چيزهای خيلی كوچك بايد موجودات زنده ای باشند. ولی اين چيزها به قدری كوچك بودند كه فقط مثل نقطه ها و ميله های كوچكی به نظر می آمدند. او نمی توانست عدسی ديگری بسازد كه آن قدر قوی باشد كه بتواند آنها را واضح نشان دهد. اين بود كه ناچار مطالعه آنها را رها كرد.

بعدها اين چيزهای كوچك را كه او نخستين بار ديد باكتری ناميدند. باكتری از واژه ای يونانی به معنی ميله كوچك گرفته شده است. ليوون هوك نخستين كسی بود كه ميكروبها را ديد, و تا صد سال بعد هيچ كس ديگری پيدا نشد كه بتواند كاری بهتر از او انجام دهد. سر انجام, در سالهای دهه 1780 ميلادی, اوتوفريدريك مولر, زيست شناس دانماركی ترتيبی داد كه ميكروبها اندكی واضعتر نشان داده شوند. او نخستين كسی بود كه كوشيد تا باكتريها را برحسب شلهای متفاوت آنها به گروههای مختلف تقسيم كند.

عدسيها برای اينكه چيزها را بزرگتر از آنچه هستند نشان دهند پرتوهای نور را می شكنند, ولی همه رنگ های نور را به يك اندازه نمی شكنند. نور معمولی تركيبی است از چندين رنگ. در آن زمان, وقتيكه ميكروسكوپها را طوری ميزان می كردند كه چيزهای كوچك را به يكی از اين چند رنگ بطور واضح نشان دهند, رنگهای ديگر مبهم می شدند. برای همين باكتريهايی كه زير ميكروسكوپ ديده می شدند مبهم به نظر می آمدند و مثل اين بود كه كرك رنگينی دورشان را گرفته باشد. ولی در سال 1830 ميلادی, جوزف جكسون ليستر, عينكساز انگليسی كه سر و كارش با ساختن عدسی بود, دو نوع عدسی را با هم تركيب كرد. هر يك از آنها رنگها را به نحو متفاوتی می شكست. هر تاثيری كه يك عدسی در رنگها داشت, عكس آن تاثير را عدسی ديگر در آنها داشت, چنانكه يك عدسی تاثيرهای نامساعد عدسی ديگر را خنثی می كرد. به اين ترتيب, تركيب اين دو نوع عدسی با يكديگر سبب می شد كه چيزهای كوچك به رنگ اصلی خود و بطور واضح نشان داده شوند. با بهبود روشهای ميكروسكوپی, دانشمندان توانستند بافتهای گوناگون را بررسی كنند.

اختراع ميكروسكوپ تحول بزرگی در علم زيست شناسی بوجود آورد. با به كارگيری اين ابزار قوی, بشر توانست ذراتی را كه با چشم ديده نمی شوند مشاهده كند: يك سلول جانوری را در نظر بگيريد كه قطر متوسط آن بين ۱۰تا۲۰ است این سلول ۵۰بار کوچکتر ازریزترین جسم قابل روئیت با چشم غیر مسلح است بنابراین تنها با اختراع میکروسوپ نوری بود که آدمی توانست سلول را ببیند.

بعد از گذشت چند قرن, ميكروسكوپ همچنان نقش مهمی در پژوهش های زيستی ايفا می كند و در سالهای اخير تحولات شگرفی در بهبود كيفيت آن صورت گرفته است. يكی از عمده ترين پيشرفتها در ساخت ميكروسكوپ, اختراع نوع الكترونی آن در دهه 1940 بود كه امكان مشاهده ذرات و اندامكهای درون سلولی را بهتر از گذشته فراهم كرد. در ضمن بايد تاكيد شود كه امروزه ميكروسكوپ نه تنها جهت بررسی شكل و ساختار نمونه های زيستی مورد استفاده قرار می گيرد, بلكه براي تعيين ارتباط بين ساختارهای تشكيل دهنده سلول و فعاليتهای گوناگون آنها نيز نقش به سزايی ايفا می كند. انواع ميكروسكوپها شامل موارد زير می باشد:

1- ميكروسكوپ زمينه روشن  2- ميكروسكوپ فلور سنت 3- ميكروسكوپ اختلاف فاز 4- ميكروسكوپ تداخلی  5- ميكروسكوپ زمينه سياه 6- ميكروسكوپ الكترونی گذاره 7- ميكروسكوپ الكترونی نگاره 8- ميكروسكوپ STM

تقسيم بندي انواع ميكروسكوپ

1-  ميكروسكوپ نوري ( Light Microscope   )

منبع نور در اين ميكروسكوپ نور مرئي ميباشد و با عبور از چندين عدسي محدب كه در آن تعبيه شده است و نيز يك منشور كه مسير نور را تغيير ميدهد ( قدرت تفكيك 24/0 ميكرون ) .

ميكروسكوپهای نوری

ميكروسكوپ نوری زمينه روشن: قسمتهای مهم يك ميكروسكوپ نوری عبارتند از:

1- عدسی چشمی: اين عدسی برای مطالعه و مشاهده تصوير است.

2- عدسی شيئی: اين عدسی برای بزرگنمايی است و شامل چهار عدسی می باشد:

الف) عدسی شماره 4 (عدسی كوچك)

ب) عدسی شماره 10 (عدسی خشك)

ج) عدسی شماره 40 (عدسی خشك)

د) عدسی شماره 100 (عدسی روغنی)

3- كندانسور: كندانسور نور را جمع كرده و آن را بطور مستقيم روی نمونه هدايت می كند.

4- ديافراگم: مقدار نور ورودی را كم و زياد می كند.

5- ماكرومتر:ماكرومتر صفحه ميكروسكوپ را بالا و پايين برده و برای پيدا كردن تصوير نمونه بكار می رود.

6- ميكرومتر: تصوير تنظيم شده را واضحتر كرده و آن را برای مشاده مشخص تر می كند.

بين عدسی شيئی (عدسی 100) و نمونه فاصله ای در حدودmm 1/8  وجود دارد كه اين فاصله را فاصله كانونی گويند كه با روغن امرسيون اين فاصله را پر می كنند در غير اين صورت بعلت وجود هوا و شكست نور عبوری از نمونه, تصوير ناواضح خواهد بود.

نمونه روی لام (تيغ شيشه ای) گذاشته می شود و سپس روی جايگاه نمونه ميكروسكوپ قرار می گيرد. نور از چراغی در پايين ميكروسكوپ توسط كندانسور بر سطح نمونه متمركز می شود. نوری كه توسط نمونه جذب نشده و از آن عبور كرده است به عدسی شيئی می رسد و در نتيجه تصويری بزرگ شده از نمونه بدست می آيد. اين تصوير بار ديگر توسط عدسی چشمی بزرگ می شود. بزرگنمايی نهايی, حاصل ضرب بزرگنمايی های دو عدسی است. چنانچه بزرگنمايی عدسی شيئی 100 و بزرگنمايی عدسی چشمی 10 باشد, بزرگنمايی نهايی 1000 برابر خواهد بود.

مهمترين ويژگی عدسی ميكروسكوپ قدرت جداسازی يعنی توانايی تشخيص بين دو نقطه نزديك به هم است. قدرت جداسازی يك ميكروسكوپ در عمل نمايانگر كوچكترين جسم قابل رويت با آن ميكروسكوپ است و هر چه بيشتر باشد, اجسام كوچكتری را با آن ميكروسكوپ می توان ديد. قدرت جداسازی هر ميكروسكوپ معمولاَ با حد تفكيك يا R مشخص می شود. حد تفكيك مساوی است با نزديكترين فاصله بين دو جسم بطوريكه هر يك هنوز بصورت مجزا قابل مشاهده باشد. هر قدر ميزان R كوچكتر باشد, قدرت جداسازی ميكروسكوپ بيشتر و بهتر است. عوامل بسياری در تعيين R دخالت دارند, از جمله طول موج تابش كه با R رابطه مستقيم دارد. از لحاظ نظری, كوچكترين مقدار ممكن برای R در ميكروسكوپ نور حدود 200nm است كه تنها بهترين ميكروسكوپهای نوری اين حد تفكيك را دارند. حد تفكيك در اغلب ميكروسكوپ های نوری كمتر از 500nm نيست, لذا اشيايی كوچكتر از 500nm با آنها قابل مشاهده نيستند. مشاهده سلولهای باكتری و ميتوكندری با ميكروسكوپ نوری مقدور است, اما مشاهده ريبوزوم ها با آن ممكن نيست. تفكيك انواع سلولها, مثلاَ گلبول های قرمز از گلبولهای سفيد خون يا سلولهای فيبرو بلاستی از سلولهای پوششی با ميكروسكوپ نوری امكان پذير است. اين ميكروسكوپ در آزمايشات باكتری شناسی, انگل شناسی, قارچ شناسی, حشره شناسی و بافت شناسی كاربرد دارد.

اجزاي ميكروسكوپ نوري

       1- اجزاي نوري : اجزاي نوري عمدتاً مشتمل بر منبع تغذيه نور و قطعات مرتبط با آن ميباشد ، از قبيل لامپ با ولتاژ 20 وات ، فيلتر تصحيح نور و كندانسور كه كندانسور مشمل بر پنج قطعه است كه نور را تصحيح كرده و بر روي نمونه يا شيء مورد بررسي متمركز ميكند:

1 – فيلتر رنگي ( تصحيح نور )                     2 – ديافراگم كه حجم نور را تنظيم ميكند

3 – دو عدد عدسي محدب        4 – پيچ نگهدارنده كندانسور       5 - پيچ تنظيم ديافراگم

       2 – اجزاي مكانيكي :

1 – پايه ( Base ) : كليه قطعات ميكروسكوپ بر روي پايه مستقر ميباشد . در برخي از مدلهاي ميكروسكوپ نوري منبع نور ، فيوز و كابل برق در پايه تعبيه ميگردد .

2 – دسته ( Handle ) : جهت حمل و نقل ميكروسكوپ از دسته استفاده ميشود . نكته قابل توجه آنكه به هنگام جابجايي ميكروسكوپ آن را روي ميز كار نمي كشيم .

3 – لوله ميكروسكوپ  ( Barrel ): مشتمل بر عدسي شيئي ( Ocular lens ) و عدسي چشمي (Objective lens) كه با بزرگنــمائي هاي مختلف طراحي مي شوند. عــدسي شيـئي داراي بزرگنمائي هاي X4 ، X10 ،X40 ، X60 و X100 و عدسي چشمي داراي بزرگنمائي هاي X10 ، X15 ، X18 ميباشد كه بسته به نوع ميكروسكوپ متفاوت است. عدسي شيئي معمولاً از چندين عدسي محدب كه در آن تعبيه شده است تشكيل ميگردد.

4 -  صفحه گردان يا متحرك ( Revolver ) : عدسيهاي شيئي بر روي اين صفحه قرار ميگيرند و با چرخاندن آن موقعيت عدسيهاي شيئي تغيير ميكند.

5 -  پيچ حركات تند ( Macrometrique ) : اين پيچ بر روي دسته تعبيه شده است و باعث ميگردد كه صفحه پلاتين با سرعت بيشتري در جهت عمودي جابجا شود.

6 – پيچ حركات كند ( Micrometrique ) : اين پيچ بر روي پيچ حركات تند قرار داد و صفحه پلاتين را در جهت عمودي و درحد ميكرون جابجا ميكند .

7 – صفحه پلاتين ( Platine plate )  : صفحه اي است كه نمونه مورد نظر روي آن قرار ميگيرد و در جهت طول و عرض داراي دو خط كش مدرج ميباشد كه جهت ثبت و يادداشت مكان يك نمونه خاص بكار ميرود .

8 – پيچ طول و عرض : اين پيچ زير صفحه پلاتين قرار دارد كه آن را در جهت طول و عرض جابجا ميكند .

بزرگنمائي يك ميكروسكوپ حاصل ضرب بزرگنمائي عدسي شيئي در بزرگنمائي عدسي چشمي ميباشد .

2 – ميكروسكوپ ماوراء بنفش ( Ultra Violet Microscope )

ميكروسكوپ ماوراء بنفش يا ميكروسكوپ U.V.  كه منبع تغذيه نور ، اشعه U.V. ميباشد. نسبت به ميكروسكوپ نوري معمولي قدرت تفكيك بالاتري داشته چراكه اشعه ماوراء بنفش طول موج كوتاهتري نسبت به نور مرئي دارد . عدسي شيئي بكار رفته در اين ميكروسكوپ از جنس كوارتز ميباشد. بدليل مضر بودن اشعه ماوراء بنفش براي چشم انسان، از تصوير شيء عكسبرداري شده و سپس بر روي صفحه مانيتور قابل مشاهده است ( قدرت تفكيك 600 آنگستروم ).

 3 – ميكروسكوپ فلورسانس (Fluorescence Microscope )

میکروسکوپ فلورسانت (fluorescent microscope)

انواع خاصی از میکروسکوپ نوری که منبع نور آن پرتوهای فرابنفش است.برای مشاهده نمونه زیر این میکروسکوپ ها بخش ها یا ملکول های ویژه داخل سلول با مواد فلورسانت یا نورافشان رنگ آمیزی می شوند. زمانی هدف تشخیص پروتئین های خاص یا جایگاه آنها در سلول باشد، روش های معمولی رنگ آمیزی که پروتئین ها را به طور عام رنگ می کنند قابل استفاده نیست.برای رنگ آمیزی اختصاصی، معمولا از پادتن های اختصاصی متصل به مواد فلورسانت استفاده می شود.مواد فلورسانت نور را در طول موج فرابنفش جذب می کنند و در طول موج بلندتری در طیف مرئی تابش می کنند. تصویری که دیده می شود حاصل نور تابش شده از نمونه است. رودامین و فلورسئین دو نوع از رنگ های معمول فلورسانت هستند که به ترتیب نور قرمز و سبز از خود تابش می کنند.

کارکرد ميکروسکوپ هاي فلورسانس

کارکرد ميکروسکوپ هاي فلورسانس

در ابتداي قرن بيستم پديده فلورسانس در ساخت ميکروسکوپ به کار گرفته شد. فلورسانس يکي از پديده هاي مربوط به نورتابي(لومين سانس) است. ما معمولاً وقتي جسمي را مي بينيم که نور از آن جسم بازتاب مي شود. رنگ جسم نيز به اين موضوع وابسته است که جسم چه طول موجي را بازتاب مي کند. در پديده فلورسانس مولکول يک فوتون(يک ذره نور) با طول موج خاص را جذب و سپس آن را با طول موج بلندتري منتشر مي کند.فلورسانس يکي از روش هاي بسيار متداول در تصويربرداري بافت هاي زيست شناختي است. مواد زيست شناختي معمولاً نور را به شدت متفرق مي کنند و در نتيجه تماشاي آن وراي سطح سلول دشوار است. در پديده فلورسانس معمولاً طول موج نور گسيل شده از طول موج نور تابيده شده بيشتر است، بنابراين نور متفرق شده از سطح سلول را مي توان از نور تابيده شده به سلول تفکيک کرد. براي انجام اين کار از آينه هاي دورنگي استفاده مي کنند. اين آينه ها نور تابيده شده را دوباره به نمونه برمي گردانند، اما نور فلورسانس از آن عبور مي کند، در نتيجه تماشاي ساختارهاي دروني سلول امکان پذير مي شود.برخي مواد زيست شناختي به طور طبيعي فلورسنت هستند، اما رنگ ها و پروتئين هاي فلورسنت فراواني نيز وجود دارد که مي توان از آنها براي رنگ آميزي بخش هاي ويژه يک سلول مثل هسته استفاده کرد. حتي مي توان آنها را به پروتئين هاي خاص درون سلول متصل کرد، در نتيجه پيگيري حرکت آنها درون سلول امکان پذير مي شود.استفاده از رنگ ها و پروتئين هاي نور کليد زدني فلورسنت که به تازگي کشف شده است، کاربردهاي بسياري در تصويربرداري فلورسانس دارد. اين مولکول ها مي توانند دو حالت داشته باشند؛ يک حالت درخشان يا حالت فلورسنت و يک حالت تاريک يا غيرفلورسنت.کليدزني بين اين دو حالت با تاباندن نور با دو طول موج متفاوت انجام مي شود.

يکي از کاربردهاي مولکول هاي نور کليدزدني رديابي پروتئين ها است. اگر مولکول هاي فلورسنت به پروتئين هاي خاص متصل شوند و يک بخش کوچک از آنها فعال شود، پيگيري جابه جايي پروتئين ها بسيار آسان تر از حالتي است که همه پروتئين هاي درون سلول نور را گسيل کنند. علاوه بر اين لحظه دقيق فعال سازي را مي توان کنترل کرد.

قدرت تفکيک زياد بدون کشتن نمونه

چگونه مي توان بدون آنکه نمونه هاي زيست شناختي را از بين برد، ميکروسکوپ هايي با قدرت تفکيک زياد ساخت؟ از آنجايي که قدرت تفکيک يک ميکروسکوپ به طول موج بستگي دارد، يک راه براي افزايش قدرت تفکيک کاهش دادن طول موج است.

برای مشاهده نمونه بوسيله اين ميكروسكوپ ها, بخش ها يا مولكول های ويژه در داخل سلول با مواد فلورسنت يا نور افشان رنگ آميزی می شوند. زمانی كه هدف تشخيص پروتئين های خاص يا جايگاه آنها در سلول باشد, روش های معمول رنگ آميزی كه پروتئين ها را به طور عام رنگ می كنند قابل استفاده نيستند. برای رنگ آميزی اختصاصی, معمولاَ از پادتن های اختصاصی متصل به مواد فلورسنت استفاده می شود.

در ميكروسكوپ فلورسنت از ماوراء بنفش بعنوان نور استفاده می شود. ماوراء بنفش طول موج كمتر، انرژی بيشتر و قدرت نفوذ زيادی دارد. عدسی هايی كه در ميكروسكوپ فلورسنت به كار رفته اند از جنس كوارتز می باشد چون نور ماوراء بنفش از عدسی های معمولی عبور نمی كند.

اين نوع ميكروسكوپ به دو دسته فيلتر مجهز هستند. دسته اول بين منبع نور و نمونه قرار دارد و فقط اجازه می دهد كه امواج تابش شده از ماده فلورسنت، عبور نمايند. دسته دوم بين نمونه و عدسی چشمی قرار دارد و تنها به امواج تابش شده از ماده فلورسنت، اجازه عبور می دهد. رود امين و فلورسئين دو نوع از رنگهای معمولی فلورسنت هستند كه به ترتيب نور قرمز و سبز از خود تابش می كنند. اين ميكروسكوپ برای مطالعه انواع آنتی بادی از نظر ايمنی شناسی و بررسی بعضی از باكتريها مثل مايكو باكتريوم توبركلوزيس ( ميكروب سل) از نظر باكتری شناسی كار برد دارد.

بطوركلي مواد از لحاظ خاصيت فلورسانس دو نوعند :

- فلورسانس اوليه كه اين مواد ذاتاٌ خاصيت فلورسانس دارند يعني از خود نور ساطع ميكنند مثل ويتامينها و رنگها .

- فلورسانس ثانويه كه از خود خاصيت فلورسانسي نداشته و با رنگ آميزي و معرفهاي گوناگون از قبيل سولفات بربرين و نارنجي آكريدين خاصيت فلورسانسي را به آنها القاء ميكنيم. 

منبع تغذيه نور در اين ميكروسكوپ اشعه U.V. ميباشد. در اينجا نيز از تصوير شيء عكسبرداري شده كه بر روي صفحه مانيتور قابل مشاهده است

 4 –  ميكروسكوپ زمينه سياه ( Dark Field Microscope )

مطالعه سلول های زنده با اين ميكروسكوپ ها نيز مقدور است. سيستم های نوری خاصی در تمام اين نوع ميكروسكوپ ها وجود دارد كه تباين كافی بين اجزار سلول ايجاد كرده، مشاهده سلول های زنده را مقدور می سازند.

در ميكروسكوپ زمينه سياه نور حامله از منبع نوری به شكل مخروط در می آيد و انوار از اطراف به نمونه تابيده می شود اين كار توسط كندانسور خاص اين ميكروسكوپ انجام می گيرد. در نتيجه تصوير نمونه بصورت روشن در يك زمينه تاريك مشاهده می شود. استفاده از ميكروسكوپ زمينه سياه برای مشاهده حركت باكتری معمول است ( مثل اسپيروكت تروپونها پاليدوم ( عامل بيماری سيفيليس).

منبع تغذيه نور در اين نوع ميكروسكوپ نور مرئي ميباشد و با ايجاد انكسار نور توسط آئينه هاي محدب و مقعر شيء يا نمونه مورد بررسي، شفاف و نوراني در زمينه سياه ديده ميشود.

5 -  ميكروسكوپ اختلاف فاز ( Phase Contrast Microscope )

مزیت میکروسکوپ اختلاف فاز در این است که می توانیم با آن سلول های زنده را با جزئیات بیشتر مشاهده کنیم.تیمارهایی مثل تثبیت نمونه می توانند دگرگونی هایی در ساختار درونی سلول بوجود آورند. بنابراین مطالعه سلول های زنده که هیچ تیماری ندیده اند خیلی مطلوب است. می توان فرایند هایی مثل تقسیم میتوز(mitosis) در سلول های زنده را نیز با این میکروسکوپ ها مطالعه کرد. در برخی موارد برای عکس برداری پیوسته و دراز مدت از سلول فعال ، دوربینی به میکروسکوپ وصل می شود.مطالعه سلول های زنده با میکروسکوپ تداخلی(interference microscope) و میکروسکوپ زمینه سیاه(dark field microscope) نیز مقدور است. سیسم های نوری خاصی در تمام این نوع میکروسکوپ ها وجود دارد که به علت ویژگی آنها تباین کافی بین اجزای سلول ایجاد و مشاهده ی سلول های زنده مقدور می شود. استفاده از میکروسکوپ زمینه سیاه برای مشاهده ی حرکت باکتری معمول است، که در این مورد ایجاد تباین بین سلول باکتری زنده و محیط اطرافش مهم است.

مزيّت ميكروسكوپ اختلاف فاز در اين است كه می توانيم با آن سلولهای زنده را با جزئيات بيشتر مشاهده كنيم. تيمهايی مثل تثبيت نمونه می توانند دگرگونی هايی در ساختار درونی سلول، بوجود آورند. بنابراين مطالعه سلول های زنده ای كه هيچ گونه تيماری نديده اند خيلی مطلوب است. می توان فرآيندهايی مثل تقسيم ميتوز در سلول های زنده را نيز با اين نوع ميكروسكوپ ها مطالعه كرد. در برخی موارد، برای عكس برداری پيوسته و دراز مدت از سلول فعال، دوربين به ميكروسكوپ وصل می شود.

در ميكروسكوپ اختلاف فاز نور حاصله از منبع نوری به انوار مختلف شكسته شده و شكسته نشده تقسيم می شود اين كار توس ديافراگم مخصوص اين ميكروسكوپ انجام می گيرد. انواری كه می شكنند. به جسم يا نمونه نفوذ نمی كنند اما انواری كه نمی شكنند به جسم يا نمونه نفوذ می كنند در نتيجه بين نمونه و محيط اطراف آن اختلاف بوجود می آيد و نمونه به صورت شفاف ديده می شود.

منبع تغذيه نور در اين نوع ميكروسكوپ نور مرئي ميباشد و براي بررسي بافتها يا نمونه هايي كه اختلاف انكساري نوري كمي دارند مورد استفاده قرار ميگيرد بدين منظور صفحه سوراخ داري به نام پلاك فاز در كندانسور تعبيه ميشود .

روش استفاده از میکروسکوپ فاز – کنتراست

نحوه کار با میکروسکوپ فاز – کنتراست در انواع مختلف آن متفاوت است و لذا بایستی بر اساس دستورالعمل کارخانه سازنده عمل نمود و لیکن در اکثر آنها نحوه کار با آن به شرح زیر می‌باشد:

·         لامپ را روشن نموده و سپس به تدریج شدت آنرا تا نصف یا 4/3 شدت ماکزیمم افزایش دهید. روزنه لامپ و کندانسور substage را کاملا باز نمائید. امتحان نمائید که فیلتر نوری در محل خود بطور مناسب واقع است. حلقه‌هایی که در زیر کندانسور واقع است را کنار بزنید.

·         در ابتدا با استفاده از عدسی شیئی با توان بالا (mm 4 عدسی شیئی خشک) شروع نمائید. فوکوس سیستم را تنظیم نموده به گونه‌ای که شیئی و stage را بخوبی بتوان تفکیک نمود. پس از آن عدسی شیئی را به موقعیت مربوطه‌اش منتقل نمائید.

·         کندانسور زیر stage را بگونه‌ای تنظیم نمائید که حدود 5 میلیمتر زیر stage واقع شود.

·         اسلاید را که حاوی نمونه است و همچنین لامپ آن را بر روی stage قرار دهید به گونه‌ای که فیلم به سمت بالا واقع شود. با فشار کمی بر روی اسلاید اتصال یکنواختی با stage فراهم آورید.

·         تصویر را فوکوس نموده و همچنین توجه شود که در وجود حباب بتوان آنرا مشاهده و سپس حذف نمود. جهت فوکوس نمودن اگر خطی بر روی اسلاید قرار دارد و یا آنکه در صورت نبودن می‌توان از خود نمونه برای فوکوس نمودن استفاده نمود. عمل فوکوس کردن با یستی بدقت انجام شود.

·         یکی از عدسیهای چشمی را برداشته و بجایش تلسکوپ مربوطه را بگذارید. با حرکت دادن آن ، آنرا برای صفحه فاز در بالای عدسی شیئی فوکوس نمائید. فوکوس میکروسکوپ را تغییر نداده و توسط چشمی کنترل کندی که فوکوس آن تغییر نکرده است.

·         صفحه دیافراگم مناسب عدسی شیئی مورد استفاده را در محل خود بین کندانسور و لامپ قرار دهید. سپس کندانسور را فوکوس نمائید بگونه‌ای که تصویر حلقه روشن از داخل تلسکوپ برابر با حلقه روی صفحه فاز باشد. مجددا از طریق چشم دیگر که هنوز در محل خودش قرار دارد ببنید که هنوز تصویر فوکوس می‌باشد.

·         با کنار زدن دیافراگم مجددا به داخل تلسکوپ نگاه نموده و با تغییر پیچهای مربوط به کندانسور آنرا بگونه‌ای تنظیم نمائید که تصویر فیلمان بطور واضح روی حلقه مربوط به صفحه فاز قرار گیرد.

·         دیافراگم را مجددا به محل خود برگردانید در حالی که بداخل تلسکوپ نگاه می‌کنید و سپس دیافراگم را به مرکز بوسیله پیچهای مربوطه منتقل نمائید. حلقه روشن بایستی دقیقا در بین حلقه‌های صفحه فاز قرار گیرند. لبه‌های این دو بایستی بر روی همدیگر بیفتد و در ضمن بایستی برنگ سفید باشد و نه رنگ دیگر. اندازه حلقه نوری را می‌توان با تنظیم فوکوس کندانسور تنظیم نمود.

·         مجددا از طریق عدسی چشمی که هنوز در محل خود قرار دارد به نمونه نگاه کرده و امتحان کنید که هنوز سیستم فوکوس می‌باشد. در صورت لزوم بایستی فوکوس را تنظیم نمود. در این حالت با نگاه به داخل تلسکوپ مجدددا حلقه نور را تنظیم نمائید.

·         تلسکوپ را خارج نموده و مجدددا عدسی چشمی دوم را سر جایش بگذارید. نمونه را مورد مطالعه قرار داده ضمن آنکه در صورت نیاز بایستی نور را نیز تنظیم نمائیم با حرکت دادن نمونه می‌توان ضخامتها و نواحی مختلف نمونه را بررسی و مطالعه نمود. هر از چند گاهی با جایگزین تلسکوپ وضعیت حلقه روشن را امتحان نمائید.

·         آزمایش با عدسی mm 2 امیرسیون روغنی: فوکوس سیستم را چرخانده به گونه‌ای که بوضوح بتوان اسلاید و عدسی شیئی را مشاهده نمود. دیافراگم را برداشته و سپس یک قطره روغن روی لامل قرار دهید. عدسی mm 2 ایمرسیون روغنی را به محل خود منتقل نموده و سپس فوکوس را حرکت داده به گونه‌ای که بین عدسی شیئی و روغن تماس برقرار شود. مراحل 14 تا 11 را با استفاده از دیافراگم مناسب عدسی مورد استفاده تکرار نمائید.

6 -  ميكروسكوپ الكتروني ( Electron Microscope )

قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی از میکروسکوپ نوری بهتر است به این معنی که با میکروسکوپ الکترونی اجزای کوچکتری را می توان دید. قبلا گفته شد حد تفکیک (R) به طول موج نوری بستگی دارد که به نمونه می تابد. در حقیقت بین این دو رابطه مستقیمی وجود دارد یعنی هر چقدر طول موج تابشی کوچکتر باشد ،R نیز کوچکتر و قدرت جداسازی بیشتر است. در میکروسکوپ الکترونی بجای استفاده از نور مرئی از امواج الکترون ها استفاده می شود. در شرایط مناسب طول موج الکترون ها به nm ۰/۰۰۵ می رسد. در این طول موج بهترین R ممکن حدود nm ۰/۰۰۲ است. در عمل به علت محدودیت های دیگر ، قدرت جداسازی میکروسکوپ های الکترونی هیچ وقت به این خوبی نیست.حد تفکیک با میکروسکوپ الکترونی برای ملکول های تخلیص شده ی زیستی ، حدود ۰/۱ نانومتر و برای سلول ها ۲ نانومتر است که دست کم 100 برابر بهتر از بهترین میکروسکوپ های نوری است.

دو نوع میکروسکوپ الکترونی به نام میکروسکوپ الکترونی گذاره و میکروسکوپ الکترونی نگاره وجود دارد. میکروسکوپ الکترونی گذاره (transmission electron microscope) زودتر اختراع شد و قدرت جداسازی بهتری دارد. در این نوع میکروسکوپ ، الکترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می کنند و از مناطقی دیگر بازتابیده می شوند. عامل تعیین کننده در این امر در نهایت ویژگی اتم های تشکیل دهنده ی مناطق مختلف سلول است. الکترون های عبوری در دستگاه تشخیص داده می شوند و تصویری از نمونه حاصل می شود. سلول های زنده با میکروسکوپ الکترونی قابل مشاهده نیست.

يكي از تجهيزات بزرگ علمي ميكروسكوپ الكتروني است كه براساس قوانين نوري كار ميكند دراين دستگاه شار الكترون پر انرژي از يك منبع الكترون خارج شده وتحت شتاب به طرف هدف ميرود در مسير خود از روزنه هاي تعبيه شده در يك فلز عبور كرده وبا عبور از لنزهاي مغناطيسي بر روي شي مورد نظر تابانده شده ودر نتيجه بازتاب نور تصوير شي ديده خواهد شد.

اطلاعاتي را كه ميكروسكوپ الكتروني ارائه ميدهد:

1 - توپوگرافي شئ : (نقشه برداري )كه با اشكار كردن مشخصات سطح و بافت داخلي شئ ميتوان به خواصي مانند سفتي و ميزان ار تجائي بودن ان پي برد.

2 - مورفولوژي (ريخت شناسي): از ان رو كه در اين رويت شكل و سايز ذرات مشخص است ميتوان به سختي و استحكام پي برد.

3 - تركيب: اين ميكروسكوپ ميتواند عناصر سازنده شئ را مشخص نمايد بنابراين ميتوان به خواصي مانند نقطه ذوب اكتيويته شئ نيز دست يافت.

4 - بلور شنا سي: ميكرو سكوپ الكتروني چگونگي چيده شدن اتمها را در مجاورت يكديگر را مي دهد وبه اين تر تيب ميتوان انها را از نظر رسانايي و خواص الكتريكي بررسي نمود.

منبع : khayam.persianblog.com

پيشرفته ترين ميكروسكوپ قرن حاضر، با قدرت تفكيك 2 آنگستروم است. در اين ميكروسكوپ با عبور پرتوهاي الكتروني ساطع شده از رشته سيمي تنگستن با طول موج بسيار پائين از عدسي هاي متعدد كه در نهايت بر روي يك صفحه فلورسنت يا صفحه مانيتور، عكسبرداري صورت گرفته و تصوير شيء قابل مشاهده ميباشد.

قدرت جداسازی ميكروسكوبهای الكترونی از ميكروسكوپ نوری بهتر است به اين معنی كه با ميكروسكوپهای الكترونی اجزای كوچكتر را می توان ديد. قبلاً متذكر شديم كه بين R و طول موج نور تابيده شده به نمونه رابطه مستقيمی برقرار است، يعنی هر چقدر طول موج تابشی كوچكتر باشد، R نيز كوچكتر و قدرت جداسازی بيشتر است. طول موج نور مرئی بين mm300 تا 800mm و بهترين حد تفكيك ميكروسكوپهای نوری 200nm است.

در ميكروسكوپهای الكترونی به جای استفاده از امواج نور مرئی، از امواج الكترونها استفاده می شود. در شرايط مناسب، طول موج الكترونها به ۰.۰۰۵ نانومتر  می رسد، يعنی حدود 000/100 برابر كوتاهتر از طول موج نور مرئی. در اين طول موج، بهترين R ممكن حدود ۰.۰۰۲ نانومتر است. در عمل، به علت محدوديتهای ديگر، قدرت جداسازی ميكروسكوپهای الكترونی هيچ وقت به اين خوبی نيست. حد تفكيك (R) با ميكروسكوپ الكترونی برای مولكولهای تخليص شده زيستی، حدود nm0.1 و برای سلول ها حدود 2nm است كه دست كم صد برابر بهتر از ميكروسكوپ های نور است.

دو نوع ميكروسكوپ الكترونی بنام های ميكروسكوپ الكترونی گذاره و ميكروسكوپ الكترونی نگاره وجود دارد.

ميكروسكوپ الكترونی گذاره:

اين ميكروسكوپ زودتر اختراع شده و قدرت جداسازی بهتری دارد. در اين نوع ميكروسكوپ، الكترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می كنند و از مناطقی ديگر بازتابيده می شوند. الكترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخی مناطق آن عبور می كنند و از مناطقی ديگر بازتابيده می شوند. الكترون های عبوری در دستگاه تشخيص داده می شوند و تصويری از نمونه حاصل می شود. جزئيات روش های تثبيت، برش گيری و رنگ آميزی برای ميكروسكوپ الكترونی اختصاصي است. به عنوان مثال، برای رنگ آميزی نمونه از فلزات سنگين مانند طلا استفاده می شود تا الكترون ها از اندامك ها و ساختارهای درون سلولی، مثل ريبوزوم، و مولكول های بزرگ سلول مثل DNA، با ميكروسكوپ الكترونی گذاره قابل تشخيص هستند، اما جايگاه اتم های تشخيص دهنده مولكول ها معمولاً تعيين نمی شود.

 ميكروسكوپ الكترونی نگاره:

میکروسکوپ الکترونی نگاره (scanning electron microscope) نوع ساده تر میکروسکوپ الکترونی است برای بررسی نمونه با این میکروسکوپ ، نمونه با لایه ای نازک از فلز سنگین به صورت یکنواخت پوشیده شود. الکترون های تابیده شده به سطح نمونه از هیچ ناحیه ای از آن عبور نمی کنند، بلکه در برخورد با سطح نمونه باعث تولید الکترون های بازتابیده می شوند. این الکترون ها تشخیص داده شده و تصویری سه بعدی از سطح نمونه حاصل می گردد. قدرت جداسازی میکروسکوپ الکترونی نگاره حدود nm10 است.

اين نوع ساده ترين ميكروسكوپ الكترونی است. برای بررسی نمونه با اين نوع ميكروسكوپ، نمونه با لايه ای نازك از فلز سنگين به صورت يكنواخت پوشيده می شود. الكترونهای تابيده شده به سطح نمونه از هيچ ناحيه ای از آن عبور نمی كنند، بلكه در برخورد با سطح نمونه باعث توليد الكترون های بازتابيده می شوند، اين الكترونها تشخيص داده می شوند و تصويری سه بعدی از سطح نمونه حاصل می گردد. حد تفكيك ميكروسكوپ الكترونی نگاره حدود 10nm است.

ميكروسكوپ STM :( Microscope  Scanning Tunnelig)

میکروسکوپ STM و میکروسکوپ پرتو X

STM حروف اول Scanning Tunneling Microscope است این نوع میکروسکوپ در دهه 1970 اختراع شد و مخترعان آن در سال 1981 جایزه نوبل را دریافت کردند.همانطور که گفته شد طول موج محدودیتی برای میزان R تعیین می کند. نوآوری STM در این است که در آن امواج نوری یا امواج نوع دیگر به کار گرفته نمی شودو هیچ نوع عدسی در آن وجود ندارد.بیان دقیق نحوه کار این میکروسکوپ خارج از توان این مطلب است ولی به طور خلاصه سوندی که نوک آن به اندازه یک اتم است، ویژگی های نمونه را در ابعاد اتمی روبش می کند. STM ساختار سطحی نمونه را بررسی می کند.اما میکروسکوپ مشابه دیگر ویژگی های الکتریکی ، مغناطیسی و یا دمای نمونه را تعیین می کنند. در حال حاضر این میکروسکوپ ها برای نمونه های زیستی و بیشتر برای نمونه های غیر زیستی مورد استفاده قرار می گیرند.

میکروسکوپ پرتو X نوع دیگری از میکروسکوپ های نوین است که کاربرد بیشتری برای نمونه های زیستی دارد. قدرت جداسازی آن چند صد آنگستروم و ضعیف تر از میکروسکوپ الکترونی است ، اما سلول های زنده با آن قابل بررسی هستند

STM حروف اول Microscope  Scanning Tunnelig  است. اين نوع ميكروسكوپ در دهه 1970 اختراع شد و مخترعان آن در سال 1981 جايزه نوبل را دريافت كردند. همان طور كه گفته شد طول موج، محدوديتی برای ميزان R تعيين می كند. نوآوری STM در اين است كه در آن امواج نوری يا امواج نوع ديگری بكار گرفته نمی شوند و هيچ نوع عدسی در آن وجود ندارد. بطور خلاصه سوندی كه نوك آن به اندازه يك اتم است، ويژگی های نمونه را در ابعاد اتمی روبش می كند. STM ساختار سطحی نمونه را بررسی می كند اما میكروسكوپ های مشابه ديگر ويژگی های الكتريكی، مغناطيسی و يا دمای نمونه را تعيين می كنند. در حال حاضر اين ميكروسكوپ ها برای نمونه ای زيستی و بيشتر برای نمونه های غير زيستی مورد استفاده قرار می گيرند.

میکروسکوپ های پلاریزان

در بسیاری از مطالعات میکروسکوپی مثل مطالعه سنگها ، مواد شیمیایی کریستالی و بسیاری از ترکیبات آلی مثل ساختمان کراتین ، عضلات ، کلاژنها نیاز به استفاده از میکروسکوپهای پلاریزان می‌باشد. جز اینها در مطالعات میکروسکوپی پلاریزان نور پلاریزه می‌باشد.

نور پلاریزه

نور معمولی متشکل از فوتونها هستند دارای بردارهای الکتریکی و مغناطیسی عمود بر هم می‌باشند. این دو میدان بطور سینوسی در حال نوسان می‌باشند و در ضمن در جهت عمود بر صفحه دو میدان و یا صفحه ارتعاشات این دو منتشر می‌شوند. ارتعاشات میدان الکتریکی نور غیر پلاریزه در یک نقطه در همه جهات می‌باشد. اکثر مواد شیشه‌ای و بسیاری از مواد دارای این ویژگی هستند که وقتی یک دسته پرتو نوری به آنها وارد شود در آن صورت سرعت انتشار و نحوه انتشار نور در جهات مختلف در آنها مشابه و یکسان می‌باشد و تنها تغییری که در نحوه حرکت دسته پرتو ضمن عبور از این مواد حاصل می‌شود آن است که بر اساس قوانین اسنل مسیر و جهت آنها نسبت به قبل از ورودشان به آن ماده تغییر می‌کند. اینگونه مواد را مواد ایزوتروپیک (isotropic) می‌نامند. مواد ایزوتروپیک در همه جهات دارای ضزیب شکست مشابه هستند.

بعضی مواد شفاف و نیمه شفاف دارای دو ضریب شکست می‌باشند، یعنی نحوه انتشار نور در داخل این مواد در جهات مختلف متفاوت است. وقتی که یک دسته پرتو نوری به داخل این گونه مواد وارد می‌شود اگر نور غیر پلاریزه باشد در آنصورت به دو دسته پرتو تقسیم می‌شود. این دو دسته پرتو در جهات عمود بر هم حرکت می‌کنند و ارتعاشات میدان الکتریکی آْنها کاملا بر هم عمود می‌باشد. هر دسته پرتو بنام نور پلاریزه شده و صفحه ارتعاش آنها را صفحه پلاریزاسیون می‌نامند. موادی که دارای این چنین خاصیتی هستند بنام مواد غیر ایزوتوپ می‌نامند. بعضی مواقع نیز اینگونه مواد را مواد با ضریب شکست دو گانه می‌نامند. در بررسیهای پلاریزاسیون لازم است که ما نور پلاریزه داشته باشیم این عمل را بوسیله یک صفحه پلاریزور می‌توان انجام داد. نور خارج شده از صفحه پلاریزور یک نور پلاریز است. میدان الکتریکی این فوتونها تنها در امتداد محور پلاریزاسیون صفحه پلاریزور ارتعاش می‌نماید.

روشهای تولید نور پلاریزه

نور پلاریزه را می توان به طرق مختلف ایجاد نمود. روشهاتی معمول عبارتند از:

بازتابش

شکست مضاعف

جذب انتخابی

پراکندگی

در اینجا دو روش ایجاد نور پلاریزه مورد نیاز در میکروسکوپهای پلاریزان را مختصرا توضیح می‌دهیم:

منشور نیکول

این منشور از بلور کلسیت درست شده است (کلسیت یا کربنات کلسیم). نور هنگام عبور از بلور کلسیت به دو دسته پرتو تجزیه می‌شود به گونه‌ای که اگر این بلور را مثلا بر روی نوشته‌ای قرار دهیم نوشته‌ها بصورت مضاعف دیده می‌شود. نور وارد شده به کلسیت به دو دسته پرتو تجزیه می‌شود، که یکی تابع قوانین اسنل است که آنرا شعاع عادی می‌نامند. دسته پرتو دیگر از قوانین نور عادی پیروی نمی‌کند لذا به آن پرتو غیر عادی گویند. مسیر نور عادی و نور غیر عادی و همچنین سرعت انتشار این دو دسته پرتو با همدیگر متفاوت است، البته هر دو دسته پرتو نور پلاریزه می‌باشند.

منشور نیکول (Nicol) بدین گونه ساخته می‌شود که یک بلور کلسیت را در امتداد قطرش برش می‌دهند سپس قطعات بدست آمده را بوسیله صمغ مخصوصی بنام صمغ کانادا (Canada blasm) به همدیگر می‌چسبانند. ضریب شکست این ماده 55/1 است که از ضریب شکست کلسیت برای شعاع عادی 656/1n= کمتر است و از ضریب شکست شعاع غیر عادی 482/1=n بیشتر می‌باشد. لذا وقتی که نور به محل اتصال دو نیمه می‌رسد نور غیر عادی انعکاس کلی پیدا می‌کند و تنها نور عادی از آن خارج می‌شود و بنابراین نور خارج شده یک دسته پرتو پلاریزه شده می‌باشد. می‌توان پلاریزه بودن نور خارج شده را بوسیله یک منشور دوم امتحان نمود. در صورتی که دو منشور نیکل به موازات همدیگر قرار گیرند نور خارج شده از اولی بدون تغییر از دومی نیز خارج می‌شود و در صورتی که محور پلاریزاسیون آنها عمود بر هم قرار گیرند نور پلاریزه خارج شده از اولی از دومی عبور نمی‌نماید.

تورمالین

نوع دیگری از پلاریزورها که بر اساس جذب انتخابی عمل می‌کنند موادی مثل تورمالین می‌باشند. اینگونه مواد وقتی نور غیرپلاریزه به آنها بتاید پس از ورود مثل بلور کلسیت در آن شکست مضاعف اتفاق می‌افتد و لیکن شعاع عادی آن در صورت ضخامت کافی بلور کاملا در داخل بلور جذب می‌شود و شعاع غیر عادی از بلور خارج می‌شود. بنابراین بلور تورمالین ارتعاشات را در یک راستا جذب و ارتعاشات در جهت عمود بر آن را عبور می‌دهد. این خاصیت تورمالین مربوط به ساختمان ملکولی آن می‌باشد. ماده تورمالین را نمی‌توان به جای منشور نیکول استفاده نمود، بخاطر آنکه این بلور رنگین است لذا نور سفید از آن عبور نمی‌کند.

آنالیزور (Analyser)

آنالیزور یک پلاریزور دیگر است که نحوه کار آن دقیقا مشابه پلاریزر است بجز آنکه محل نصب آن در پشت پلاریزور واقع می‌باشد. آنالیزور در میکروسکوپهای پلاریزان بین عدسی شیئی و چشم مشاهده کننده واقع است. موقعی که در میکروسکوپها از منشور نیکول استفاده می‌شود. معمولا آنرا درست بالای عدسی شیئی و یا درست بالای عدسی چشمی قرار می‌دهند تا از ایجاد مانع در مقابل نور جلوگیری نماید و لیکن در میکروسکوپهایی که از فیلترهای پلاروئید به عنوان آنالیزور استفاده می‌شود این ----- در داخل لوله عدسی نصب می‌گردد و دارای ورنیه می‌باشد که درصد چرخش آنرا می‌توان مشخص نمود.

عمدتا وقتی که نمونه‌ها را بوسیله نور پلاریزه مورد تابش قرار دهیم و مشاهده نمائیم تصویر مشابه حالتی است که از نور غیر پلاریزه استفاده می‌شود. اما وقتی که در مقابل آن یک آنالیزور قرار دهیم در آنصورت مشاهده می‌شود که با چرخش آنالیزور در جهات مختلف روشنایی تصویر متفاوت خواهد بود. در حالتی که محور پلاریزاسیون پلاریزور و آنالیزور بر همدیگر عمود باشند، در آن صورت نوری از آن به چشم مشاهده گر نمی‌رسد و در صورتی که دو محور به موازات هم باشند حداکثر نور خارج می‌شود. در این صورت می‌توان تأثیر نمونه در چرخش نور را مشاهده و اندازه گیری نمود. در حالتی که محور پلاریزاسیون پلاریزور و آنالیزور بر همدیگر عمود باشند کلیه نورهایی که مستیقما از پلاریزور به آنالیزور می‌رسند متوقف می‌شوند و از آن خارج نمی‌شوند و تنها آن بخش از نورهایی که بوسیله نمونه خارج و تغییر جهت داده می‌شود بوسیله آنالیزور عبور داده می‌شود و می‌توان بنابراین تأثیر نمونه را بر روی نور پلاریزه عبوری مطالعه نمود.

عدسیهای مختلفی که در ساختمان میکروسکوپهای پلاریزان مورد استفاده قرار می‌گیرد بایستی بدون هیچگونه رگه باشد و علاوه بر آن نبایستی خود دارای اثر پلاریزه کنندگی باشند. در صورتی که از میکروسکوپهای معمولی بخواهیم برای بررسی خواص کندانسور استفاده نماییم باید آن را آزمایش نمود که این اشکالات در آنها وجود نداشته باشد. وجود زاویه در هر یک از عدسیها خود می‌تواند موجب اثر پلاریزه کنندگی نور شود و بنابراین برای مطالعه نمونه‌هایی که خاصیت پلاریزه کنندگی آنها کم است بهتر است روزنه نور را تا حد ممکن کم نمود تا تأثیر زاویه دار بودن کمتر شود.

وسایل ملحقات یک میکروسکوپ پلاریزان

با اضافه کردن وسایل لازمه به یک میکروسکوپ به گونه‌ای که بتوان در آن از نور پلاریزه استفاده نمود اطلاعات مفیدی از نمونه‌ها می‌توان بدست آورد. در حالت بسیار ساده می‌توان با افزودن یک صفحه ساده پلاریزور و یک صفحه آنالیزر که بشود آنها را چرخاند می‌تواند این کار انجام شود. لیکن در اندازه گیریهای دقیق و مواقعی که اندازه گیری مقداری مورد نیاز باشد بایستی از میکروسکوپ پلاریزان استفاده شود. تجهیزات اضافی یک میکروسکوپ پلاریزان را می‌توان بطور مختصر بصورت زیر برشمرد:

پلاریزور و آنالیزور که بتوانند به داخل و یا خارج محلهای مربوطه منتقل شوند و همچنین حول محور قائم بچرخند و در ضمن جهت آنها نیز نسبت به همدیگر قابل تعیین باشد.

خطوط متقاطع که بر روی چشمی نصب شوند بگونه‌ای که بتواند پس از نصب و تنظیم ثابت شوند و از چرخش آن جلوگیری نماید. خارهایی که بتوان خطوط را بطور ثابت بطرف شمال – جنوب ، شرق – غرب یا در زاویه 45 درجه نسبت به این جهتها قرار دهد.

پایه نگه دارنده نمونه (machanical stage) که بتوان آنرا به تدریج بوسیله یک ورنیه چرخاند.

وسیله مناسب برای چرخاندن و یا انتقال پایه (stage) و هم محور کردن با محور اپتیکی.

شیارهایی در بدنه جهت وارد کردن جبران کننده. جبران کننده‌ها در زیر پلاریزر در شکاف مخصوص خود قرار می‌گیرند. این وسایل جهت جبران تأخیر فاز نمونه‌های بلورین ناشناخته بکار می‌روند.

یکم مرحله کندانسور در بالای پلاریزور

یک عدسی برتراند و دیافراگم برزای امتحان و بررسی نوارهای تداخلی.

میکروسکوپ تداخلی

میکروسکوپهای تداخلی بوسیله کمپانی‌های متعددی ساخته می‌شوند. این میکروسکوپها دارای ساختارهای متعدد و متفاوتی می‌باشند، اساس کار این میکروسکوپها بر مبنای تداخل نور عبور نموده از نمونه‌های شفاف که دارای فازهای متفاوت هستند و یا تداخل نور منعکس شده از نمونه‌های کدر یا پرتوهای نور دیگری که با این نورها دارای اختلاف راه هستند عمل می‌نماید و بدین طریق ساختار داخلی نمونه و یا سطح آن قابل مشاهده می‌شوند. در صورتی که از طریق تداخل نورهای عبور نموده از نمونه تصویر بدست آید، روش عمل کنتراست تداخلی دیفرانسیلی (DIC) و در صورتی که تصویر از انعکاس سطح نمونه حاصل شود آنرا میکروسکوپ تداخلی انعکاسی می‌نامند.

میکروسکوپ تداخلی DIC

در یک سیستم DIC نور عبور نموده از هر قسمت نمونه مواجه با بخشی از نمونه است که با قسمتهای مجاور دارای اختلاف فاز می‌باشد. علت این تفاوت فاز مربوط به ضریب شکست متفاوت نمونه می‌باشد. در اثر تداخل حاصله بین نورهای خارج شده از نواحی مختلف قابل مشاهده می‌شوند. نور حاصله از چشمه به دو بخش تقسیم می‌شود. دسته پرتو R بنام مرجع (Reference beam) شناخته شده است با دسته پرتو O که از نمونه مورد آزمایش عبور نموده است تداخل نموده و بخاطر آنکه دو دسته پرتو O,R دو دسته پرتو همدوس می‌باشند، لذا نوارهای تداخلی قابل تشخیص تشکیل می‌گردد. روش تصویر با استفاده از دسته پرتوهای مختلف و ایجاد تداخل برای مدت زمان بسیار طولانی مورد استفاده قرار گرفته است. یکی از طرقی که بسیار مورد استفاده قرار گرفته است، روش مربوط به جامین (Jamin) می‌باشد. در این روش با توجه به روش پلاریزاسیون دو دسته پرتو را از یک دسته پرتو ایجاد نموده و سپس آن دو را با همدیگر ترکیب می‌نماید.

تداخل سنج جامین (Jamin’s interferometer)

شکل و نحوه کار سیستم اینتروفرومتر ابداع شده بوسیله جامین در شکل مقابل نشان داده شده است.

نور از چشمه S توسط صفحه پلاریزور S به نور پلاریزه تبدیل می‌شود و سپس بوسیله صفحه کلسیت C به دو دسته پرتو عادی و غیر هعادی تبدیل می‌شود. پس از آن نور از یک صفحه نیم موج عبور نموده و نتیجتا نور O به طور غیر عادی و نور E نور عادی تبدیل می‌شوند. پس از آن این دو پرتو از صفحه کلسیت دوم عبور نموده ، این صفحه مشابه صفحه اول می‌باشد. در اثر پدیده فاز موج تغییر نموده و در نتیجه تداخل این دو موج تولید نوارهای تداخلی می‌شود که قابل دیدن است.

میکروسکوپ تداخلی اسمیت- بیکر

اسمیت و بیکر در واقع جز اولین کسانی بودند که با کاربرد سیستمهای تداخلی ، میکروسکوپ تداخلی را بصورت عملی طراحی نموده و با استفاده از آنها با توانائی زیاد توانستند تصاویر مناسب تهیه نمایند. روشهای متعدد دیگری نیز در ساختن میکروسکوپهای پلاریزان بکار رفته است که در اینجا در مورد آنها توضیح داده نمی شود.

مقایسه با میکروسکوپ فاز کنتراست

در سیستم میکروسکوپهای فاز کنتراست تفاوت اختلاف راه ایجاد شده که موجب تداخل می‌شود منحصرا در اثر ماهیت نمونه می‌باشد. این در حالی است که در سیستم میکروسکوپهای تداخلی عمل تداخل منحصرا بوسیله نمونه ایجاد نمی‌شود، بلکه اختلاف راه حاصله مربوط به سیستم ساختمانی در میکروسکوپ است که در اثر چگونگی قرار گرفتن اجزاء ایجاد می‌شود. بنابراین موقعی که ماهیت نمونه به گونه‌ای باشد که نتواند به حد کافی موجب ایجاد تداخل شود در آنصورت می‌توان این عمل را بسادگی با استفاده از میکروسکوپهای تداخلی انجام داد. استفاده از میکروسکوپهای فاز کنتراست بعضی مواقع موجب آرتی‌فکتهائی می‌شود که این مشکل در سیستمهای میکروسکوپ تداخلی واقع نمی‌شود. میکروسکوپهای تداخلی حتی می‌تواند برای نمونه‌های غیر شفاف (نمونه‌های رنگ شده) بکار رود و وضوح تصویر بسیار خوب باشد. تصویرهای حاصله با میکروسکوپهای تداخلی دارای حالت شبه سه بعدی تا حدی مشابه میکروسکوپهای الکترونی می‌باشد. در این نوع میکروسکوپ معمولا نوارهای تداخلی کناره‌های تصویر بخاطر اثر هال ظاهر نمی‌شود.

عمق میدان وضوح در میکروسکوپهای تداخلی دو تا سه برابر بیشتر از میکروسکوپهای فاز کنتراست می‌باشد. در صورت استفاده از نور تکرنگ روشنائی تصویر در میکروسکوپهای تداخلی بیشتر از میکروسکوپهای فاز کنتراست می‌باشد. در این نوع میکروسکوپها در صورتی که اختلاف فاز ایجاد شده حتی برابر چندین طول موج هم باشد باز هم تصویر دارای وضوح زیاد است و لذا نمونه با ضخامت حدود mm 5/0 هم باز قابل مشاهده با این میکروسکوپها هستند، در حالی که میکروسکوپ فاز کنتراست برای نمونه‌های بسیار نازک حدود 10 میکرون یا کمتر می‌باشند به گونه‌ای که موجب اختلاف فاز زیاد نشوند.

میکروسکوپ تداخلی انعکاسی

سطوح با ضریب انعکاس کم و یا زیاد - سطوح فلزی یا غیر فلزی ، سطوح مناسبی برای امتحان با استفاده از میکروسکوپ تداخلی می‌باشد. تصویر بزرگ شده سطح را می‌توان بوسیله میکروسکوپ مشاهده نمود. در صورتی که سطح مورد مطالعه کاملا مسطح و صاف باشد نوارهای تداخلی منظم و با فاصله مشخص تشکیل می‌شود. این در حالی است که اگر سطح دارای ترک و یا لکه‌ای باشد در آن صورت تصویر تداخلی تشکیل شده نامنظم و متفاوت خواهد بود. اگر چه سیستم عدسیهای استفاده شده متفاوت است و لیکن اساس کار آنها با همدیگر مشابه می‌باشد. نور به میکروسکوپ وارد شده و به سطح تحت آزمایش از طریق یک تابش کننده عمودی وارد می‌شود. بخشی از نور توسط سطح نیمه منعکس کننده R منعکس می‌شود و سطح t را مورد تابش قرار می‌دهد. از این سطح نور منعکس شده و با نور مربوط به سطح جسم ترکیب می‌شود. با تغییر اندکی روی سطح نگهدارنده شیئی با سطح تداخلی یک شیب فازی در سیستم ایجاد می‌شود و نتیجتا موجب تشکیل نوارهای تداخلی در صفحه تصویر می‌شود.